Сайт в стадии разработки [Старая версия сайта]
Самый цитируемый биологический институт РФ *
PDF Печать E-mail
Принадлежит к подразделению: Отдел молекулярной энергетики микроорганизмов
Руководитель: доктор биологических наук, зав. лабораторией, Константинов Александр Александрович

Лаборатория занимается изучением механизма переноса электронов и трансформации энергии в электрон-транспортных цепях митохондрий и бактерий. Вся дыхательная цепь разделена на 4 комплекса, в каждом из которых происходит запасание энергии окисляемых субстратов в виде трансмембранной разности электрических потенциалов ионов водорода, ∆μН+. В лаборатории занимаются изучением механизма работы комплекса II, сукцинатдегидрогеназы из Bacilus subtilis (Н.В.Ацаркина), но основное внимание сотрудников сфокусировано на терминальном участке, комплексе IV, представленном оксидазами разного типа, которые катализируют перенос электронов на молекулярный кислород, восстанавливая его до воды.

Объект исследования

В лаборатории исследуется широкий спектр терминальных оксидаз, отличающихся как механизмом работы, так и структурой редокс-центров, а также сукцинат. Наиболее типичные из изучаемых оксидаз - митохондриальная цитохром с-оксидаза из сердца быка, бактериальные оксидазы из Rhodobacter sphaeroides и Paracoccus denitrificans,- относятся к семейству гем-медных оксидаз аа3-типа класса «А». Они имеют 4 редокс-центра: биядерный медный центр CuA , через который электроны попадают в фермент, низкоспиновый гем а и высокоспиновый гем а3 , который вместе с центром CuВ образует сопряженно работающий биядерный активный центр, где происходит восстановление кислорода согласно реакции:

О2 + 4е- + 4Н+хим 2H2О+4Н+помп

У традиционных оксидаз класса «А» при восстановлении О2 через толщу мембраны электрогенно перекачиваются 8 зарядов: 4 заряда образуются за счет встречного перемещения к активному центру 4-х электронов (поступают снаружи от цитохрома с) и 4-х «химических» протона (4Н+хим, транспортируются изнутри), потребляемых при образовании воды, и еще 4 заряда, так называемые 4 «помповых» протона (4Н+помп), перекачиваются дополнительно через всю толщу мембраны изнутри наружу. Соотношение Н+помп/е-, измеряемое по закислению наружной среды, а также структура так называемых «входных» протонных каналов, выявляемых в 3-х мерной структуре фермента, по которым протоны доставляются изнутри в активный центр, являются характерным признаком, на котором базируется современная классификация оксидаз. У самых типичных оксидаз класса «А», о которых говорилось выше, Н+помп/е-=1 и имеется 2 «входных» протонных канала, названных по характерным аминокислотным остаткам «K»- и «D»-каналами.

Среди более редких представителей оксидаз, изучаемых в лаборатории, надоотметить цитохромоксидазу bа3–типа из термофильной бактерии Thermus thermophilus, относящейся к оксидазам класса «Б», для которых Н+помп/е- <1 (0.5 или меньше по данным разных групп) и структура протонных каналов имеет мало гомологии с «K»- и «D»-каналами оксидаз «А» класса, а, возможно, работает всего 1 канал, аналог канала «D». В.Б.Борисовым исследуются представители оксидаз bd-типа, выделяемые из разных источников (E.coli, Azotobacter vinelandi и др.). Эти оксидазы изучены слабо, не относятся к гем-медному семейству, не помпируют протоны и имеют в активном центре хлорин d вместо гема.

Методы исследования

Для изучения спектральных свойств оксидаз и их взаимодействия с экзогенными лигандами в лаборатории используются разнообразные спектроскопические методы включая спектроскопию КД и МКД (кругового дихроизма и магнитного кругового дихроизма), флуоресцентную и абсорбционную дифференциальную спектроскопию и др. Реакции, протекающие с высокими скоростями, исследуются на спектрофотометре с приставкой для быстрого смешивания (спектрофотометр SX-20 «Applied Photophysics»), который снабжен фотодиодной матрицей для быстрой регистрации спектров поглощения (400 - 1600 спектров в секундном временном интервале) в рабочем диапазоне ~350-750 нм. Для исследования быстрой кинетики генерации разности электрических потенциалов цитохромоксидазой (ЦО), встроенной в липосомы, используется уникальный прямой электрометрический метод измерений, разработанный в 1974г сотрудником Института Белозерского, Л.А.Драчевым. Липосомы с встроенной ЦО подклеиваются к коллодиевой пленке, разделяющей 2 отсека, заполненных буфером. В результате возбуждения лазерной вспышкой фотоактивного донора (RuBpy) в фермент мгновенно впрыскивается электрон и запускается ¼ цикла работы ЦО, в ходе которого с помощью вольтметра замеряется разность потенциалов между отсеками, отслеживающая с высоким временным разрешением движение зарядов (электронов и протонов) внутри встроенной в мембрану белковой глобулы. Сотрудникам лаборатории удалось впервые применить прямой электрометрический метод для изучения механизма работы ЦО [Konstantinov et al.1997], и сейчас аналогичные установки появились в нескольких лабораториях за рубежом как самый мощный инструмент исследования механизма работы терминальных оксидаз.

Основные достижения

  1. Установлено, что каталитический цикл цитохромоксидазы состоит из двух фаз – эу-оксидазной (двухэлектронное восстановление кислорода до связанной перекиси) и пероксидазной (две последовательные одноэлектронные стадии восстановления связанной перекиси до воды) [Pecoraro et al., 2001].

  2. Методом прямой электрометрии разрешены и охарактеризованы индивидуальные стадии внутрибелкового переноса заряда (электронов и протонов) в ходе пероксидазной фазы цитохромоксидазного цикла [Siletsky et al., 1999].

  3. С помощью направленного мутагенеза отдельных аминокислот в составе входных протонных каналов цитохромоксидазы определена их роль в ходе реакции восстановления кислорода в активном центре [Konstantinov et al., 1997].

  4. Предложена модель строения активного центра оксидазы bd типа [Borisov et al., 2002]

  5. Определена ведущая роль консервативного аспартата в цитоплазматической петле между XI и XII α-спиралями субъединицы I в связывании Са2+-цитохромоксидазой [Kirichenko et al., 2005]

Международное сотрудничество, грантовская поддержка

Работа лаборатории поддерживается грантами РФФИ, а также грантами международных фондов. В разные годы были гранты INTAS, Fogarty, CRDF, Howard Hughes.
Налажено сотрудничество с Иллинойским университетом (Урбана-Шампейн, Ил., США), Хельсинским университетом, Университетом г.Рима.

Научные премии

Научные достижения отдела отмечены премиями «Ленинского комсомола» (Константинов А.А.), премия по биохимии им. Баха (Константинов А.А.), «Молодые ученые России» (Борисов В.Б. и Силецкий С.А.), Европейской академии (Борисов В.Б. и Силецкий С.А.), Всеросийского биохимического общества для молодых ученых (Борисов В.Б. и Силецкий С.А.).

Обновлено 30.03.2012 08:04
Все статьи
  1. Dyuba A.V., Vygodina T., Azarkina N., Konstantinov A.A. (2015) Calcium ions inhibit reduction of heme a in bovine cytochrome c oxidase. FEBS Lett., 589 (24): 3853-3858. >>

  2. Vygodina T.V., Kirichenko A., Konstantinov A.A. (2014) Cation Binding Site of cytochrome c oxidase: Progress report. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg., 1837 (7): 1188-1195. >>

  3. Dyuba A.V., Vygodina T.V., Konstantinov A.A. (2013) Reconstruction of absolute absorption spectrum of reduced heme a in cytochrome c oxidase from bovine heart. Biochem.-Moscow, 78 (12): 1358-1365. >>

  4. Dyuba A.V., Arutyunyan A.M., Vygodina T.V., Konstantinov A.A. (2012) Modeling the circular dichroism and absorption spectra of complexes FI and FII of cytochrome c oxidase. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg., 1817: 0-0. >>

  5. Vygodina T.V., Dyuba A.V., Konstantinov A.A. (2012) Effect of calcium ions on electron transfer between hemes a and a (3) in cytochrome c oxidase. Biochem.-Moscow, 77 (8): 901-909. >>

  6. Siletsky S.A., Konstantinov A.A. (2012) Cytochrome c oxidase: Charge translocation coupled to single-electron partial steps of the catalytic cycle. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg., 1817 (4): 476-488. >>

  7. Konstantinov A.A. (2012) Cytochrome c oxidase: Intermediates of the catalytic cycle and their energy-coupled interconversion. FEBS Lett., 586 (5): 630-639. >>

  8. Dyuba A.V., Arutyunyan A.M., Vygodina T.V., Azarkina N.V., Kalinovich A.V., Sharonov Y.A., Konstantinov A.A. (2011) Circular dichroism spectra of cytochrome c oxidase. Metallomics, 3 (4): 417-432.

  9. Bolshakov I.A., Vygodina T.V., Gennis R., Karyakin A.A., Konstantinov A.A. (2010) Catalase Activity of Cytochrome c Oxidase Assayed with Hydrogen Peroxide-Sensitive Electrode Microsensor. Biochemistry-Moscow, 75 (11): 1352-1360.

  10. Azarkina N.V., Konstantinov A.A. (2010) Electrogenicity of succinate: Menaquinone oxidoreductase from Bacillus subtilis depends on the direction of electron transfer. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1797: 112.

  11. Dyuba A.V., Vygodina T.V., Azarkina N.V., Arutyunyan A.M., Sharonov Y.A., Kalinovich A.V., Konstantinov A.A. (2010) Circular dichroism of cytochrome c oxidase: Modeling spectra using classical polarizability theory. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1797: 94-95.

  12. Kalinovich A.V., Azarkina N.V., Vygodina T.V., Soulimane T., Konstantinov A.A. (2010) Pecularities of cyanide binding to ba(3)-type cytochrome oxidase from a thermophilic bacterium Thermus thermophlius. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1797: 96.

  13. Konstantinov A.A. (2010) Cytochrome c oxidase: Electrogenic mechanism and regulation by calcium ions. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1797: 92.

  14. Vygodina T.V., Konstantinov A.A. (2010) Ca(2+) -induced inhibition of the mammalian cytochrome c oxidase. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1797: 102.

  15. Siletsky S.A., Zhu J.P., Gennis R.B., Konstantinov A.A. (2010) Partial Steps of Charge Trans location in the Nonpumping N139L Mutant of Rhodobacter sphaeroides Cytochrome c Oxidase with a Blocked D-Channel. Biochemistry, 49 (14): 3060-3073.

  16. Borisov V.B., Davletshin A.I., Konstantinov A.A. (2010) Peroxidase activity of cytochrome bd from Escherichia coli. Biochemistry-Moscow, 75 (4): 428-436.

  17. Kalinovich A.V., Azarkina N.V., Vygodina T.V., Soulimane T., Konstantinov A.A. (2010) Peculiarities of cyanide binding to the ba (3)-type cytochrome oxidase from the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Biochemistry-Moscow, 75 (3): 342-352.

  18. Azarkina N.V., Konstantinov A.A. (2010) Energization of Bacillus subtilis Membrane Vesicles Increases Catalytic Activity of Succinate: Menaquinone Oxidoreductase. Biochemistry-Moscow, 75 (1): 50-62.

  19. Borisov V.B., Forte E., Giuffre A., Konstantinov A., Sarti P. (2009) Reaction of nitric oxide with the oxidized di-heme and heme-copper oxygen-reducing centers of terminal oxidases: Different reaction pathways and end-products. Journal of Inorganic Biochemistry, 103 (8): 1185-1187.

  20. Zakirzianova W., Vygodina T., Konstantinov A. (2009) Zn(2+) added from P-side block with high affinity cytochrome c oxidase in phospholipid vesicles or in intact mitochondria. FEBS Journal, 276: 354.

  21. Vygodina T.V., Zakirzianova W., Konstantinov A.A. (2008) Inhibition of membrane-bound cytochrome c oxidase by zinc ions: High-affinity Zn(2+)-binding site at the P-side of the membrane. FEBS Letters, 582 (30): 4158-4162.

  22. Yang K., Borisov V.B., Konstantinov A.A., Gennis R.B. (2008) The fully oxidized form of the cytochrome bd quinol oxidase from E-coli does not participate in the catalytic cycle: Direct evidence from rapid kinetics studies. FEBS Letters, 582 (25): 3705-3709.

  23. Smirnova I.A., Zaslavsky D., Fee J.A., Gennis R.B., Brzezinski P. (2008) Electron and proton transfer in the ba(3) oxidase from Thermus thermophilus. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 40 (4): 281-287.

  24. Belevich I., Siletsky S.A., Jasaitis A., Konstantinov A.A., Wikstrom M., Soulimane T., Verkhovsky M.I. (2008) Single-turnover of ba(3) oxidase from Thermus thermophilus. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1777: S73-S73.

  25. Vygodina T.V., Ptushenko V.V., Konstantinov A.A. (2008) Ca2+ binding to cytochrome c oxidase affects redox properties of heme a. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1777: S110-S111.

  26. Arutyunyan A.M, Borisov V.B, Novoderezhkin V.I, Ghaim J., Zhang J., Gennis R.B, Konstantinov A.A. (2008) Strong excitonic interactions in the oxygen-reducing site of bd-type oxidase: the Fe-to-Fe distance between hemes d and b595 is 10 A. Biochemistry, 47 (6): 1752-1759. >>

  27. Siletsky S.A., Belevich I., Jasaitis A., Konstantinov A.A., Wikstrom M., Soulimane T., Verkhovsky M.I. (2007) Time-resolved single-turnover of ba(3) oxidase from Thermus thermophilus. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 1767 (12): 1383-1392.

  28. Belevich I., Borisov V.B., Bloch D.A., Konstantinov A.A., Verkhovsky M.I. (2007) Cytochrome bd from Azotobacter vinelandii: Evidence for high-affinity oxygen binding. Biochemistry, 46 (39): 11177-11184.

  29. Vygodina T.V., Konstantinov A.A. (2007) Peroxidase activity of mitochondrial cytochrome c oxidase. Biochemistry-Moscow, 72 (10): 1056-1064.

  30. Borisov V.B., Forte E., Sarti P., Brunori M., Konstantinov A.A., Giuffre A. (2007) Redox control of fast ligand dissociation from Escherichia coli cytochrome bd. Biochemical and Biophysical Research Communications, 355 (1): 97-102.

More articles